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A deficiência de vitamina D e a obesidade são um problema de saúde mundial. A obesidade se refere ao acúmulo excessivo de gorduras no corpo, o que pode levar ao desenvolvimento de doenças. Pessoas obesas têm baixos níveis de vitamina D por vários motivos, incluindo maior volume de distribuição, vitamina D fortemente ligada aos tecidos adiposos, absorção reduzida e dietas com baixa vitamina D. Medir com precisão os metabólitos da vitamina D é desafiador. O método de Cromatografia Líquida de Ultra-Alta Performance-Espectrometria de Massa em Tandem (UHPLC-MS/MS) foi desenvolvido e validado para a análise de metabólitos da vitamina D no soro. Amostras de sangue foram coletadas de 452 indivíduos, que consistiam em linha de base (sujeitos obesos com deficiência de vitamina D), acompanhamento (sujeitos obesos suplementados) e voluntários saudáveis. Os metabólitos da vitamina D foram separados adequadamente pelo método UHPLC-MS/MS desenvolvido. Além disso, os critérios de validação para o método estavam dentro de uma faixa aceitável. Os voluntários da linha de base, acompanhamento e até mesmo saudáveis eram deficientes em 25OHD3 e 25OHD2. Os indivíduos saudáveis e de linha de base tinham concentrações comparáveis de vitamina D2 e D3. No entanto, os indivíduos saudáveis tinham uma concentração maior de 25OHD e seu epímero em comparação aos indivíduos de linha de base. A vitamina D3 aumentou significativamente nos indivíduos de acompanhamento; portanto, o 25OHD3 aumentou significativamente em comparação com a linha de base também; no entanto, o aumento foi insuficiente para atingir a faixa ideal. O teste do método UHPLC-MS/MS foi aplicado com sucesso na estimativa de metabólitos de vitamina D em indivíduos. Este estudo indica a importância de levar em consideração os efeitos metabólicos e de armazenamento ao avaliar o status da vitamina D em indivíduos obesos.